Labor für Biochemie und Proteomik

Bearbeitete Erreger

• Pseudorabies Virus
• Herpes Simplex Virus-1
• Bovines Herpesvirus-1
• Influenza-A-Virus 

Kurzbeschreibung der Projekte

Anwendung von Proteomics-Techniken in der Virologie

In den letzen Jahren hat der ‚Proteomics’-Ansatz Einzug in fast alle Gebiete der  Biowissenschaften gehalten. Gemeint ist damit die qualitative und quantitative Analyse von größeren Zahlen (hunderte bis tausende) von Proteinen zur Charakterisierung eines bestimmten Zustandes der Zelle, z.B. nach einer Virusinfektion. Als analytische Plattform stehen im Labor für Biochemie und Proteomics eine großformatige zweidimensionale Gelelektrophorese, ein Roboter zum automatischen in-Gel Proteinverdau und ein Ultraflextreme TOF/TOF Massenspektrometer sowie eine LC-MALDI Kopplung zur Verfügung. Zur Analyse eukaryontischer Zellen sind quantitative Veränderungen im Proteom von besonderer Bedeutung, die sich in Zellkultur hervorragend durch das ‚stable isotope labelling with amino acids in cell culture’ (SILAC) Verfahren erfassen lassen (Ong et al., 2002). In SILAC-Studien mit Pseudorabies Virus infizierten Zellen (Skiba, Mettenleiter & Karger, 2008) konnten eine Reihe von bisher nicht beschriebenen zellulären Reaktionen auf die Infektion beschrieben werden. Die SILAC Technik erlaubt nicht nur den Vergleich von infizierten und scheininfizierten Zellen, sondern auch die quantitative Analyse von Proteomveränderungen nach Infektion mit verschiedenen Viren (Skiba et al., 2010), so dass auch die Reaktion der Zelle auf einzelne Virusproteine im Kontext einer Infektion erfasst werden kann.

Literatur:

Skiba M, Glowinski F, Koczan D, Mettenleiter TC, Karger A. (2010). Gene expression profiling of Pseudorabies virus (PrV) infected bovine cells by combination of transcript analysis and quantitative proteomic techniques. Vet Microbiol. 2010 Jun 16;143(1):14-20. Epub 2010 Feb 11.

Skiba M, Mettenleiter TC, Karger A. (2008). Quantitative whole-cell proteome analysis of pseudorabies virus-infected cells. J Virol. 2008 Oct;82(19):9689-99. Epub 2008 Jul 23.

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Zusammensetzung mutierter Pseudorabies-Virionen

Das Genom des Alphaherpesvirus Pseudorabies Virus (PrV) kodiert für über 70 Proteine, von denen viele auch Strukturbestandteile des Viruspartikels sind. Neben den viruskodierten Proteinen enthält das Viruspartikel aber auch Bestandteile der Zelle, wie z.B. die Lipidhülle, aber auch zelluläre Proteine, deren Bedeutung für die Virusmorphogenese bisher ungeklärt sind. Nach 2D-elektrophoretischer Analyse hochgereinigter Viruspartikel und massenspektrometrischer Identifizierung der Einzelkomponenten wurde eine 2D Karte des PrV erstellt. Durch Anwendung einer massenspektrometrischen Quantifizierungstechnik, die auf  stabilen Isotopen beruht (‚stable isotope labelling with amino acids in cell culture’, SILAC), konnte auch die quantitative Zusammensetzung von mutierten Pseudorabies Vironen sehr genau bestimmt werden  (Michael et al., 2006;Michael et al., 2006; Bottcher et al., 2006; Michael et al., 2007; Fuchs et al., 2007). Auf diese Weise konnten neue Erkenntnisse zu Interaktionen verschiedener Virusstrukturproteine während der Virusmorphogenese gewonnen werden. In laufenden Projekten wird an der Analyse der Zusammensetzung verschiedener Morphogenesestadien von Herpesvirionen mit Hilfe des SILAC Verfahrens gearbeitet.

Literatur:

Fuchs W, Granzow H, Klupp BG, Karger A, Michael K, Maresch C, Klopfleisch R, Mettenleiter TC. (2007). Relevance of the interaction between alphaherpesvirus UL3.5 and UL48 proteins for virion maturation and neuroinvasion. J Virol. Sep;81(17):9307-18. Epub 2007 Jun 20.

Michael K, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. (2007). Efficient incorporation of tegument proteins pUL46, pUL49, and pUS3 into pseudorabies virus particles depends on the presence of pUL21. J Virol. Jan;81(2):1048-51. Epub 2006 Nov 1.

Michael K, Böttcher S, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. (2006). Pseudorabies virus particles lacking tegument proteins pUL11 or pUL16 incorporate less full-length pUL36 than wild-type virus, but specifically accumulate a pUL36 N-terminal fragment. J Gen Virol. Dec;87(Pt 12):3503-7.

Böttcher S, Klupp BG, Granzow H, Fuchs W, Michael K, Mettenleiter TC. (2006). Identification of a 709-amino-acid internal nonessential region within the essential conserved tegument protein (p)UL36 of pseudorabies virus. J Virol. Oct;80(19):9910-5.

Michael K, Klupp BG, Mettenleiter TC, Karger A. (2006). Composition of pseudorabies virus particles lacking tegument protein US3, UL47, or UL49 or envelope glycoprotein E. J Virol. Feb;80(3):1332-9.

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Massenspektrometrische Diagnose von Influenza A Virus-Infektionen

Der Ausbruch der Vogelgrippe im Jahr 2005 hat die Bedeutung einer schnellen, sicheren und hochdurchsatzfähigen Diagnose von Infektionen mit dem Influenza A Virus (AIV) erneut unterstrichen. Im Rahmen des Forschungs-Sonderprogrammes Influenza (FSI) wurde eine auf MALDI-Massenspektrometrie basierende Diagnose von AIV entwickelt (Michael et al., 2009). Das Verfahren des ‚restriction fragment mass fingerprint’ (RFMF) beruht auf der Massenanalyse von Nukleinsäurefragmenten, die durch den Restriktionsverdau eines Amplifikates des Hämagglutin Genes des AIV gewonnen werden. Das Differenzierungsvermögen des Verfahrens ist hoch genug, um verschiedene AIV-Stämme des gleichen Subtyps H5N1 zu unterscheiden. In laufenden Projekten wird das Verfahren auf die Differenzialdiagnose verschiedener respiratorischer Pathogene des Schweins erweitert.

Michael K, Harder TC, Mettenleiter TC, Karger A. (2009). Diagnosis and strain differentiation of avian influenza viruses by restriction fragment mass analysis. J Virol Methods. Jun;158(1-2):63-9. Epub 2009 Jan 30.

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MALDI-Typisierung von Bakterien und Gewebekulturen

Die Identifizierung und taxonomische Klassifizierung von Bakterien durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (‚MALDI-typing’ oder auch ‚intact cell mass spectrometry’, ICMS) hat in den letzten Jahren Einzug in viele bakteriologische Laboratorien gehalten. Die Gründe dafür liegen vor allem in der Schnelligkeit, der hohen Kosteneffizienz und in der Hochdurchsatzfähigkeit des Verfahrens. Ausgehend von einer Bakterienkolonie kann in der Regel ein Ergebnis innerhalb von 45 Minuten erwartet werden, in günstigen Fällen innerhalb von wenigen Minuten. Die Reagenzienkosten pro Probe sind zu vernachlässigen und der Arbeitsaufwand zur Vorbereitung der Proben ist vergleichsweise gering. Die Aussagefähigkeit der Spektren kann in einzelnen Fällen die der klassischen bakteriologischen Untersuchung übertreffen oder entscheidend ergänzen.

MALDI-Typisierung beruht auf dem Vergleich des Massenpektrums der Probe mit Referenzspektren aus einer Datenbank, die selbst erstellt oder kommerziell erworben werden kann. MALDI-Typisierung ist unabhängig von molekularbiologischen Daten, z.B. Gensequenzen, des untersuchten Materials. Notwendig ist lediglich ein authentisches Referenzspektrum. Für bakteriologische Routineuntersuchungen steht eine kommerzielle Datenbank mit über 3200 Referenzspektren ebenso zur Verfügung wie eine veterinärhygienisch orientierte Referenzdatenbank mit über 300 eigenen Spektren. Referenzspektren können nicht nur zur Identifizierung unbekannter Proben, sondern auch für phylogenetische oder epidemiologische Untersuchungen herangezogen werden.
Neben der MALDI-Typisierung von Bakterien wurde in Zusammenarbeit mit der Zellbank des FLI auch ein Protokoll zur Charakterisierung von Gewebekulturen (Karger et al., 2010) etabliert, bei denen ICMS bisher noch nicht beschrieben wurde.

Literatur:

Karger, A., M. Ziller, B. Bettin, B. Mintel, S. Schares, and L. Geue. (2011). Determination of Serotypes of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates by Intact Cell Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry. Appl Environ Microbiol 77:896-905.

Karger A, Bettin B, Lenk M, Mettenleiter TC. (2010). Rapid characterisation of cell cultures by matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometric typing. J Virol Methods. 2010 Mar;164(1-2):116-21. Epub 2009 Nov 24.

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Dienstleistungen

Das Labor für Biochemie und Proteomics stellt für das FLI eine Reihe von Analysetechniken zur Verfügung:

• Identifizierung und von Proteinen durch ‚peptide mass fingerprint’ (Ultraflex TOF/TOF Massenspektrometer, Bruker)
• N- und C-terminale Partialsequenzierung von Proteinen durch ISD Massenspektren
• Zweidimensionale Gelelektrophorese, auch großformatig (Dodeca Cell, Biorad) ,Off gel’ Fokussierung (Fractionator 3200, Agilent)
• Identifizierung von Bakterien (Biotyper 2 software, Bruker)
• MALDI-imaging

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